Conseguirá a microglia saudável impedir a neuroinflamação e a disfunção sináptica em organoides cerebrais humanos com mutações associadas a DFTL?

Visão Geral

Resumo do Projecto

A demência frontotemporal (FTD) compõe um grupo heterogéneo de perturbações neurodegenerativas devastadoras, apresentando alterações distintas no comportamento, linguagem e função motora. Apesar do crescente conhecimento sobre a base genética da FTD, incluindo a recente descoberta de novos genes associados à doença, o vasto espectro de doenças genéticas e manifestações clínicas sugere a presença de uma doença extremamente complexa. Até agora, os mecanismos hipotéticos da doença incluem agregação anormal de proteínas, desregulação da tradução do ARN, diminuição da actividade proteasómica e lisossómica e um papel crucial da neuroinflamação crónica, todos convergindo para comprometer a transmissão sináptica e a sobrevivência neuronal. Esta multiplicidade de assinaturas patológicas não é completamente recapitulada nos modelos animais disponíveis e constitui um importante desafio na FTD, com impacto directo na tradução de descobertas pré-clínicas para ensaios clínicos em humanos. Tendo tudo isto em consideração, propomos a utilização de organóides cerebrais derivados de pacientes, semeados com células de microglia, para explorar os mecanismos moleculares através dos quais as mutações no gene GRN, uma das causas genéticas mais comuns da FTD, contribuem para a fisiopatologia da doença. O nosso objectivo é investigar os mecanismos pelos quais mutações no gene GRN contribuem para a proteinopatia TDP-43, para alterar a actividade homeostática da microglia e para promover a disfunção da rede neuronal. O nosso primeiro objectivo é esclarecer como a haploinsuficiência da GRN molda a função lisossómica e a via do complemento, ambas cruciais não só para a eliminação de agregados proteicos, mas também para a manutenção da função da rede e refinamento dos circuitos através da poda sináptica. Um segundo objectivo é investigar a contribuição das mutações do gene GRN na microglia para as alterações da actividade da rede identificadas nos neurónios derivados de iPSC de doentes de FTD. Com este objectivo, avaliaremos o desenvolvimento cortical e faremos uma caracterização completa dos parâmetros electrofisiológicos em organóides imunocompetentes, na presença de microglia sã ou mutante. Globalmente, esta proposta irá lançar luz sobre os mecanismos subjacentes à disfunção imunológica e sináptica observada na FTD, gerando e caracterizando simultaneamente uma nova e útil ferramenta para testar estratégias terapêuticas modificadoras da doença.

Objectivos Principais

A fim de clarificar a contribuição das mutações associadas à FTD no gene GRN para a fisiopatologia da doença e de estabelecer as bases para uma futura investigação orientada para a terapia, estabelecemos um conjunto de objectivos que permitirão gerar e caracterizar novos modelos de FTD que melhor imitem a complexidade da doença humana. Objectivo 1. Estabelecer organóides imunocompetentes de cérebro humano e células da microglia, partindo de IPSCs derivadas de doentes de FTD. Propomos gerar novas linhas iPSC a partir de pacientes FTD com mutações no gene da progranulina (GRN), que terão o duplo objectivo de gerar organóides do cérebro humano derivados de pacientes e células do tipo microglia, que estarão disponíveis para a realização de estudos funcionais. Objectivo 2. Determinar o impacto das mutações do gene GRN na função da microglia utilizando organóides cerebrais imunocompetentes derivados de pacientes. Faremos crescer organóides cerebrais derivados de pacientes com mutações GRN na presença de microglia humana derivada de iPSC dos mesmos pacientes ou de controlos saudáveis, a fim de compreender a contribuição da haploinsuficiência do gene GRN especificamente na microglia, para a acumulação de TDP-43, poda sináptica e morte neuronal. Estas experiências ajudarão a dissecar os mecanismos pelos quais a actividade lisossómica e secretora da microglia fica comprometida na presença de mutações GRN e como isto tem impacto nas interacções microglia:neurónio, que são cruciais para moldar o desenvolvimento neuronal e cortical. Objectivo 3. Avaliar as alterações na actividade electrofisiológica dos organóides cerebrais, tanto ao nível celular como da rede, na presença de microglia saudável ou mutante. Avaliaremos a actividade sináptica, rácios E/I e sincronia de rede utilizando imagens de cálcio e registos electrofisiológicos em organóides derivados de doentes, na presença de microglia sã ou mutante. Esta caracterização ajudará a dissecar a contribuição das mutações GRN para a disfunção da rede, num modelo humano realista de FTD, ao mesmo tempo que lançará luz sobre a contribuição específica da disfunção da microglia para a fisiopatologia global da doença.

Detalhes de Projeto