Edição genómica para tratamento da doença de Machado-Joseph por splicing alternativo

Visão Geral

Resumo do Projecto

A doença de Machado-Joseph (MJD) é uma patologia fatal, neurodegenerativa dominante, causada por uma repetição anormal do número de trinucleótidos CAGs localizados no exão 10 da região codificante do gene ATXN3, o que resulta numa excessiva repetição de glutaminas, conferindo toxicidade à proteína Ataxina-3 resultante. Não existe nenhuma terapia disponível para esta doença.

O silenciamento da expressão do gene ATXN3 através de sequências de RNA de interferência tornou-se a abordagem mais explorada para o tratamento da MJD, demonstrando resultados promissores em modelos pré-clínicos de roedores. No entanto, os métodos baseados em RNA de interferência apenas conseguem atingir o silenciamento de genes a nível pós-transcricional, requerendo a administração repetitiva e a longo-prazo das sequências inibitórias com o risco de saturação e toxicidade celulares. Adicionalmente, o papel da Ataxina-3 em várias funções celulares poderá indicar que silenciar totalmente a sua actividade poderá ser prejudicial para os pacientes.

Uma abordagem ideal para o tratamento da MJD seria mitigar a toxicidade causada pela expansão de CAG e preservar a atividade fisiológica da Ataxina-3. Relevante a esta questão, estudos anteriores explorando o uso de oligonucleótídos antisense para modular o splicing do gene ATXN3 demonstram que a região de polyglutaminas não é necessária para a função fisiológica da Ataxina-3, abrindo o caminho para novas abordagens terapêuticas para correcção da MJD de uma forma precisa e segura. Contudo, de forma semelhante às sequências de RNA de interferência, os oligonucleótidos antisense apenas conseguem modular a expressão génica ao nível do RNA, providenciando um efeito transiente. Deste modo, é necessário aumentar a eficiência desta abordagem e reduzir efeitos adversos através de plataformas que possam mediar um efeito permanente ao atingir o gene ATXN3 ao nível do DNA.

O desenvolvimento de plataformas de engenharia do genoma com base no sistema CRISPR abriram novas perspetivas para métodos que promovam a correção permanente de defeitos genéticos de forma específica e eficiente. Uma destas plataformas em particular, os editores de base CRISPR promovem mutações dirigidas em sequências genómicas sem causar disrupções na cadeia-dupla de DNA e de forma independente de vias reparadoras endógenas que geralmente estão inativas em células pós-mitóticas. O reconhecimento do DNA genómico é mediado por uma pequena molécula de RNA guia (sgRNA) que direciona uma nucleasse Cas9 inactiva em fusão com uma desaminase de nucleobases que promove uma conversão específica de par-de-bases. Desta forma, considerámos que poderíamos tirar partido desta plataforma inovadora para atingir e modular o splicing do gene ATXN3 ao nível do DNA para promover a eficaz remoção da região codificante de CAGs de uma forma permanente.

Neste projecto propomos desenvolver sequências de editores de base CRISPR para promover o splicing alternativo do gene ATXN3 como nova abordagem terapêutica para a MJD. A capacidade dos editores de base CRISPR para promover o splicing alternativo do gene ATXN3 e resgatar a degeneração no contexto da MJD será avaliada em células de pacientes e modelos animais. A entrega das sequências dos editores de bases será mediada por vírus adeno-associados (AAV) que promoverão elevados níveis destas ferramentas de edição no cerebelo, a região mais afectada em pacientes de MJD. Nesta proposta também iremos gerar linhas editadas no gene ATXN3 para avaliar de forma precisa o impacto do splicing alternativo num contexto de organóides cerebrais humanos. Antecipamos que o splicing alternativo do gene ATXN3 por plataformas de editores de base CRISPR abrirá caminho para uma nova abordagem de terapia génica no tratamento de pacientes de MJD e que se poderá estender a outras doenças neurodegenerativas.

Detalhes de Projeto